Przewlekła choroba ziarniniakowa przedstawiająca 69-letniego mężczyznę ad 5

Analiza sekwencji genów gp91-phox. W górnym panelu cDNA i przewidywane sekwencje aminokwasowe dla części transkryptu gp91-phox są porównywane z tymi u pacjenta, który miał delecję w ramce 30 nukleotydów. Groty wskazują miejsca splicingu, a numeracja reszt aminokwasowych jest zgodna z systemem Orkin.18 Dolny panel pokazuje fragmenty sekwencji nukleotydowej genu gp91-phox. Wielkie litery wskazują sekwencje egzonów i małe sekwencje intronów. Pokazano mutację w miejscu akceptorowym 3 intronu 11, jak również w dolnym, tajemniczym miejscu akceptorowym.
Z powodu rodzinnej historii przewlekłej choroby ziarniniakowej związanej z chromosomem X i lokalizacji defektu oksydazy pacjenta w przedziale błony postawiliśmy hipotezę, że podjednostka gp91-phox cytochromu b zawiera mutację, która doprowadziła do prawidłowych poziomów wadliwego cytochromu. W sposób zgodny z normalnym pojawieniem się obu podjednostek cytochromu w immunoblottingu, analiza Northern blot mRNA gp91-phox i p22-phox dała prawidłowe wyniki (dane nie pokazane). Jednak analiza sekwencji regionu kodującego białko transkryptu gp91-phox wykazała delecję 30-nukleotydową w ramce obejmującą nukleotydy 1464 do 1491 (ponumerowane zgodnie z systemem Orkin 18) (Fig. 3A). Przewiduje się, że kodowany polipeptyd, zwykle złożony z 570 aminokwasów, nie zawiera reszt 488 do 497.
Ponieważ delecja rozpoczęła się dokładnie na końcu 5 egzonu 12 w genie gp91-phox, 32 podejrzewaliśmy defekt w splicingu mRNA z powodu mutacji w miejscu akceptorowego składania 3 . Przy użyciu pary starterów flankujących miejsce akceptorowe 3 zamplifikowano fragment o długości około 250 bp do sekwencjonowania DNA z genomowym DNA wyizolowanym z córki nosiciela pacjenta (II-2 na Fig. 1). Mutację A-to-G w konsensusowym dinukleotydu akceptorowym AG 3 zidentyfikowano w dwóch z sześciu subklonów zsekwencjonowanych (Fig. 3B), a pozostałe cztery subklony zawierające sekwencję typu dzikiego w sposób zgodny z X-połączonym status przewoźnika. Nie zidentyfikowano żadnych innych mutacji. Następujące tajemnicze miejsce akceptorowe w sekwencji kodującej egzonu 12 musi być stosowane podczas składania mRNA zmutowanego genu (Fig. 3B), tak że 30 nukleotydów sekwencji kodującej jest wycinanych z dojrzałego transkryptu gp91-phox.
Aby potwierdzić identyfikację mutacji A-to-G w miejscu akceptorowym 3 , fragment o wielkości 250 par zasad zawierający miejsce akceptora amplifikowano z genomowego DNA wyizolowanego od pacjenta i innych dostępnych członków rodziny i hybrydyzowano z oligonukleotydami specyficznymi dla allelu ( dane nie pokazane). Fragment amplifikowany z pacjenta hybrydyzował tylko z oligonukleotydem zawierającym zmutowany dinukleotyd GG. Fragmenty z dwóch żeńskich nosicieli (II-2 i II-3 na Fig. 1) hybrydyzowały z oligonukleotydami dzikiego typu i zmutowanymi, a te z siedmiu nienarażonych członków rodziny (czworo rodzeństwa, jeden syn i dwie siostrzenice) hybrydyzowały tylko do sondy typu dzikiego.
Dyskusja
Związana z chromosomem X postać chronicznej choroby ziarniniakowatej wynika z mutacji w genie podjednostki gp9l-phox cytochromu fagocytów b, niezbędnego składnika oksydazy NADPH wytwarzającej ponadtlenek
[patrz też: tokovit, przewlekła choroba ziarniniakowa, pedicul hermal ]