Przedkliniczne rozpoznanie rodzinnej kardiomiopatii przerostowej za pomocą analizy genetycznej limfocytów krwi

Rodzinna kardiomiopatia przerostowa jest autosomalnym dominującym zaburzeniem charakteryzującym się niewyjaśnionym przerostem mięśnia sercowego.1 2 3 Rozpoznanie w dzieciństwie jest szczególnie trudne, ponieważ standardowe kliniczne i echokardiograficzne cechy choroby mogą nie występować aż do wieku dorosłego.4 Identyfikacja dotkniętych młodych ludzi jest ważna, ponieważ pierwszym objawem tego zaburzenia może być nagła śmierć. 5, 6 Genetyczne podejście do diagnozy byłoby cenne, szczególnie jeśli doprowadziło to do opracowania interwencji profilaktycznych. Diagnoza genetyczna u osób z zaburzeniami odziedziczonymi może być pośrednia i oparta na analizie powiązań lub bezpośrednio i oparta na identyfikacji specyficznej mutacji genu.7 Ponieważ rodzinna przerostowa kardiomiopatia jest genetycznie powiązana z genami ciężkiego łańcucha miozyny sercowej w wielu rodzinach, 8 9 10 11 jest bezpośrednia analiza tych genów pod kątem mutacji. Z powodzeniem zastosowano kilka metod do wykrywania mutacji powodujących choroby w genach, 7, 12, a ostatnio zidentyfikowano dwie mutacje genów łańcucha ciężkiego miozyny, które powodują rodzinną przerostową kardiomiopatię w dwóch niezwiązanych rodzinach.13, 14 Wiele podejść opiera się na analiza wariantów sekwencji nukleotydowych w eksonach, które często są chorobotwórczymi mutacjami, w przeciwieństwie do tych, które występują w intronach, które zwykle nie mają konsekwencji. Ponieważ polipeptyd ciężkiego łańcucha . serca miozyny jest kodowany w 40 eksonach rozłożonych na 30 kilopazach DNA, 15, 16 niezależnych analiz każdego eksonu byłoby pracochłonne. Dostęp do matrycowego RNA (mRNA) zapewniłby bardziej skuteczną metodę badania przesiewowego pod kątem mutacji wywołujących chorobę, ponieważ sekwencje intronów zostały wycięte z tych transkryptów. Mimo że mRNA łańcucha ciężkiego miozyny z miozyną jest obfity w sercu i wolno skurczowym mięśniu szkieletowym, jego ekspresja w innych tkankach jest niezwykle niska. 17 18 19 20
Wykorzystując reakcję łańcuchową polimerazy (PCR), wykazaliśmy, że normalny i zmutowany mRNA łańcucha ciężkiego miozyny . jest obecny w limfocytach krwi, zjawisku zwanym transkrypcją ektopową . 21 22 23 Większość rodzinnej przerostowej kardiomiopatii nie jest spowodowana dużymi delecjami lub insercje genów łańcucha ciężkiego miozyny (dane niepublikowane) i dlatego połączono amplifikację PCR z testami ochronnymi dla rybonukleazy (RNazą) (wyjaśnionymi poniżej) w celu zbadania pod kątem niewielkich delecji, insercji lub mutacji bezsensu. Wykazaliśmy kliniczną przydatność tej techniki przez naszą analizę dużej rodziny z rodzinną kardiomiopatią przerostową. Udało nam się dokonać dokładnej diagnostyki genetycznej rodzinnej kardiomiopatii przerostowej, identyfikując nową mutację missense.
Metody
Linie komórkowe i ekstrakcja DNA i RNA
Po uzyskaniu świadomej zgody zgodnie z wytycznymi Brighama i Komitetu Szpitala dla Kobiet w zakresie ochrony ludzi przed ryzykiem badawczym, krew została pobrana od członków rodziny i osób zdrowych. Próbki krwi wykorzystano do przygotowania DNA z peletek czerwonych krwinek24 i do ustalenia linii limfoblastoidalnych komórek.25 RNA otrzymano ze świeżych komórek jednojądrzastych krwi obwodowej lub linii komórkowych transformowanych Epsteina-Barr przez ekstrakcję kwasem guanidyno-tiocyjanian-fenol-chloroform. 26
PCR i analiza enzymów restrykcyjno-sekwencyjnych
Rysunek 1
[hasła pokrewne: lymphomyosot opinie, przewlekła choroba ziarniniakowa, mykofenolan mofetylu ]