Przedkliniczne rozpoznanie rodzinnej kardiomiopatii przerostowej za pomocą analizy genetycznej limfocytów krwi czesc 4

Diagnozy kliniczne zostały wykonane przez dwóch doświadczonych klinicystów, którzy nie mieli wiedzy o wynikach genotypowych. Żaden z ocenianych członków rodziny nie miał w wywiadzie nadciśnienia układowego ani ciśnienia krwi wyższego niż 140/90 mm Hg w spoczynku. Wyniki
Ograniczony dostęp do tkanki sercowej skłonił nas do ustalenia, czy istnieje ektopowa ekspresja genu ciężkiego łańcucha . serca miozyny w komórkach jednojądrzastych krwi. Aby wykryć wyjątkowo niskie poziomy mRNA łańcucha ciężkiego miozyny ., zastosowaliśmy strategię zagnieżdżonej amplifikacji PCR (ryc. 1A). Po pierwszej rundzie amplifikacji ze starterami C i D (lub A i B), żaden specyficzny produkt nie był widoczny na barwieniu bromkiem etydyny. Następnie przeprowadzono drugą rundę PCR z wewnętrznymi starterami C i D (lub A i B ) po 1000-krotnym rozcieńczeniu początkowych produktów. Sekwencyjna amplifikacja dała produkt złożony z 275 par zasad (pz) (ryc. 1B, ścieżka 1), który jest wielkością przewidywaną z sekwencji ciężkiego łańcucha . serca miozyny. W celu wykazania, że otrzymane produkty pochodzą w szczególności z genu ciężkiego łańcucha mysiej mysiej ., przeprowadzono analizę częściowej sekwencji nukleotydów na kilku fragmentach generowanych przez PCR (dane nie pokazane). Sekwencja była identyczna z poprzednią publikacją Jaenicke i wsp.15
Aby określić, czy zmutowane, jak i normalne transkrypty genu ciężkiego łańcucha miozyny . w sercu można wykryć w komórkach jednojądrzastych krwi obwodowej, przeanalizowaliśmy próbki pobrane od rodziny z rodzinną kardiomiopatią przerostową (Rodzina A). Dotknięci członkowie tej rodziny uprzednio wykazali, że mają mutację missense w eksonie 13 łańcucha ciężkiego . serca miozyny, która tworzy nowe miejsce restrykcyjne enzymu DdeI.13 RNA wytworzono z komórek transformowanych wirusem Epstein-Barr z obu dotkniętych i nietkniętych członków rodziny A i sekwencyjnie amplifikowanych za pomocą starterów C i D, a następnie C i D (ryc. 1A). Zamplifikowany produkt następnie strawiono enzymem restrykcyjnym DdeI i frakcjonowano zależnie od wielkości na żelu agarozowym. W strawionych próbkach od osób nie dotkniętych chorobą powstały dwa fragmenty. Większy z nich był łatwo widoczny na barwie bromku etydyny i składał się z około 215 pz (ryc. 1B, ścieżki 2 i 4). Trawione próbki od dotkniętych osób dały trzeci widoczny fragment składający się z około 180 pz (ryc. 1B, ścieżki 3 i 5), oprócz tych obecnych u osób nie dotkniętych chorobą. Jest to wielkość przewidziana przez dodatkowe miejsce DdeI nadane przez tę mutację rodzinnej przerostowej kardiomiopatii.13 Ektopic transkrypcja normalnego i zmutowanego allelu była zatem widoczna u osób dotkniętych chorobą, zgodnie z oczekiwaniami w autosomalnym zaburzeniu dominującym. Ponieważ powinna istnieć możliwość amplifikacji zmutowanych i prawidłowych sekwencji o równej skuteczności, intensywność barwienia bromkiem etydyny fragmentów dokładnie odzwierciedla względną obfitość tych dwóch transkryptów i pokazuje, że zmutowane i normalne allele były transkrybowane jednakowo w liniach komórkowych transformowanych przez Wirus Epstein-Barr.
Wykrywanie transkryptów z prawidłowych i zmutowanych genów łańcucha ciężkiego miozyny . w komórkach krwi obwodowej zapewnia mechanizm do szybkiej identyfikacji mutacji powodujących rodzinną przerostową kardiomiopatię
[więcej w: seminogram kraków, sinlac skład, lek pramolan ]