Przedkliniczne rozpoznanie rodzinnej kardiomiopatii przerostowej za pomocą analizy genetycznej limfocytów krwi cd

Identyfikacja mutacji w ciężkim łańcuchu mysiej . Cardio. Panel A pokazuje test ochrony przed RNazą, w którym wyznakowana 32P sonda RNA (pokazana na Fig. 1A) została poddana transkrypcji in vitro z fragmentu cDNA ciężkiego łańcucha . miozyny typu dzikiego .. Produkty amplifikacji generowane przez zagnieżdżony PCR hybrydyzowano z sondą RNA, a otrzymaną hybrydę RNA-DNA trawiono RNazą A. Nadmierne końce sondy i niedopasowane zasady (kreskowane obszary) trawiono RNazą A.30 Produkty trawienia analizowano denaturująca elektroforeza w żelu akryloamidowym. Wyniki elektroforezy przedstawiono w ramce. Próbki od osób homozygotycznych, niezmienionych (U / U) zawierają zamplifikowane fragmenty homologiczne do sondy RNA łańcucha ciężkiego miozyny . (pojedynczo wytłuszczone pasmo). Próbki od osób heterozygotycznych (U / A) zawierają te fragmenty (górny prążek) i nowe fragmenty (dwa dolne prążki) powstałe w wyniku wewnętrznego rozszczepienia w miejscu niedopasowania między sondą ciężkiego łańcucha . miozyny typu dzikiego a produktami typu dzikiego amplifikowane ze zmutowanego genu.
Panel B pokazuje wyniki testu ochrony RNA u dwóch chorych pacjentów i członków rodziny QQ. Produkty zagnieżdżonych PCR otrzymanych ze starterami A i B oraz A i B (przedstawione na Fig. 1A) analizowano w teście ochrony przed RNazą za pomocą sondy pokazanej na Figurze 1A. Próbki z dwóch niespokrewnionych, dotkniętych probandami przedstawiono na ścieżkach i 2. Pasy od 3 do 14 zawierają próbki od członków rodziny QQ, zidentyfikowane zgodnie z rodowodem przedstawionym na fig. 3 i stanem choroby. Test ochrony RNaz zidentyfikował nowy fragment (strzałka) w członku rodziny I-1, który jest obecny tylko u dotkniętych członków rodziny QQ. Kontrolne reakcje PCR nie dały widocznych fragmentów na barwieniu żelu agarozowego bromkiem etydyny (dane nie pokazane) i nie chroniły sondy RNA łańcucha ciężkiego miozyny ..
Zabezpieczenie RNazą przeprowadzono zgodnie z modyfikacją metody opisanej przez Myers i wsp. 30 (Fig. 2A) z wykorzystaniem objętości, które zostały zmniejszone trzykrotnie. Najpierw 4 .l amplifikowanego przez PCR produktu (Fig. 1A) hybrydyzowano z sondą RNA wyznakowaną 32P (200 000 zliczeń na minutę), a uzyskaną hybrydę RNA-DNA trawiono RNazą A (Sigma) i analizowano przez denaturację. elektroforeza w żelu akryloamidowym. Reakcje RNazy zatrzymano przez równoczesne dodanie proteinazy K i dodecylosiarczanu sodu i 15 .l końcowego produktu dodano do 20 .l buforu ładującego do elektroforezy bez ekstrakcji fenol-chloroform lub wytrącania etanolem.
Ocena kliniczna
Członków rodziny oceniano na podstawie badania fizykalnego, elektrokardiografii 12-odprowadzeniowej, ultrasonografii dopplerowskiej i echokardiografii dwuwymiarowej z widokami lewej i prawej komory.31 32 33 Elektrokardiogramy interpretowano zgodnie ze standardowymi kryteriami.34 Echokardiograficzne pomiary grubości ścian i wymiarów wnęki oraz obecność lub brak skurczowego ruchu przedniego zastawki mitralnej określono zgodnie z ustalonymi protokołami.31 32 33, 35 Rozpoznanie rodzinnej przerostowej kardiomiopatii oparto na wykazaniu niewyjaśnionego przerostu komór
[więcej w: lordoza szyjna spłycona, pedicul hermal, phenazolina ]