Przedkliniczne rozpoznanie rodzinnej kardiomiopatii przerostowej za pomocą analizy genetycznej limfocytów krwi ad

Identyfikacja transkryptów ciężkich łańcuchów beta miozyny . w komórkach jednojądrzastych. Panel A pokazuje zagnieżdżoną PCR używaną do amplifikacji uzupełniającego DNA (cDNA) łańcucha ciężkiego miozyny . serca, z resztami nukleotydowymi oznaczonymi liczbami. Odwrotną transkryptazę zastosowano do otrzymania cDNA z mRNA wyekstrahowanego z jednojądrzastych komórek krwi obwodowej lub linii komórkowych transformowanych wirusem Epsteina-Barr. CDNA zastosowano jako matrycę do początkowego PCR ze starterami A i B lub C i D. Otrzymane produkty rozcieńczono 1: 1000 i powtórzono PCR z wewnętrznymi starterami A i B lub C i D . Wskazano pozycje mutacji missense znalezionych w poprzednio opisanej rodzinie A (reszta 1294) iw rodzinie QQ (reszta 832). Fragment cDNA stosowany jako matryca dla rybosondemy stosowanej w testach ochrony przed RNazą (pokazany na Fig. 2) jest również wskazany. Panel B pokazuje normalne i zmutowane transkrypty ciężkiego łańcucha miozyny . serca po amplifikacji PCR. Produkty przedstawiono na 3% żelu NuSieve i 1% żelu agarozowym zabarwionym bromkiem etydyny. Ścieżka (Uncut) zawiera produkt PCR (275 bp) pochodzący z normalnych komórek jednojądrzastych krwi obwodowej ze starterami C i D oraz C i D . Ścieżki 2 do 5 zawierają produkty PCR pochodzące od nienaruszonych lub dotkniętych członków rodziny A i trawione enzymem restrykcyjnym Ddel. Zauważ, że fragment o wielkości 180 pz jest obecny tylko w produktach od dotkniętych członków rodziny, zgodnie z przewidywaniami zmutowanej sekwencji opisanej przez Geisterfer-Lowrance i wsp.13.
Zagnieżdżone PCR22 zastosowano do amplifikacji mRNA łańcucha ciężkiego miozyny . ze świeżych komórek jednojądrzastych krwi obwodowej i linii komórkowych transformowanych wirusem Epsteina-Barr (Fig. 1A). Jeden do 2 .g całkowitego RNA poddano odwrotnej transkrypcji z odwrotną transkryptazą wirusa mysiej białaczki Moloney (BRL) z 0,5 .g antysensownego startera z zewnętrznej pary starterów. Następnie przeprowadzono pierwszą rundę amplifikacji przez dodanie 0,5 .g zewnętrznego startera sensownego (Fig. 1A, A lub C) i 0,2 mmol każdego trifosforanu deoksynukleozydu (Pharmacia), w objętości 100 .l (końcowe rozcieńczenie, 1). : 1000) zawierający 10 mmol kwasu TRIS-chlorowodorowego (pH 8,3), 50 mmol chlorku potasu, 1,5 mmol chlorku magnezu i 0,01 procent (wag./obj.) Żelatyny. Czterdzieści cykli przeprowadzono w termocyklerze (Perkin-Elmer Cetus) w następujących warunkach: 0,5 minuty denaturacji w 94 ° C, minuta wyżarzania startera w 55 ° C i 2 minuty wydłużania startera w 72 ° C. Produkty PCR zostały następnie rozcieńczone 1: 100, a 10 .l zastosowano jako matrycę reakcji w objętości 100 .l buforu do PCR (końcowe rozcieńczenie, 1: 1000), w którym wewnętrzna para starterów (Fig. 1A, A ). i B lub C i D ) zastosowano w dodatkowych 40 cyklach. Po drugiej reakcji, 10 .l produktu PCR poddano elektroforezie na 2% żelu agarozowym w celu potwierdzenia pomyślnej amplifikacji. Aby uniknąć zanieczyszczenia produktów PCR, stosowano wyporowe lub filtrowane układy pipet i przeprowadzono szereg negatywnych kontroli z każdą amplifikacją. Analizę restrykcyjną tych produktów przeprowadzono zgodnie z wcześniej opisanymi technikami.27, 28 Produkty PCR sekwencjonowano, wykonując dodatkową rundę asymetrycznej amplifikacji27, po czym przeprowadzono bezpośrednią analizę sekwencji, jak opisano wcześniej dla produktów jednoniciowych.29 Genomowy DNA amplifikowano dla 35 cykli ze starterami B9.1F i B9.1R, w tym denaturacją przez 0,5 minuty w 94 ° C, wyżarzaniem primerów przez minutę w 55 ° C i wydłużaniem startera przez minutę w 72 ° C
[hasła pokrewne: seminogram kraków, mykofenolan mofetylu, lordoza szyjna spłycona ]