Przedkliniczne rozpoznanie rodzinnej kardiomiopatii przerostowej za pomocą analizy genetycznej limfocytów krwi ad 5

Jest to szczególnie ważne, ponieważ, inaczej niż w przypadku zaburzeń, takich jak niedokrwistość sierpowatokomórkowa, różne mutacje łańcucha ciężkiego miozyny . w sercu mogą powodować rodzinną przerostową kardiomiopatię w niespokrewnionych rodzinach13, 14 (i niepublikowane dane). Aby zidentyfikować pojedyncze substytucje par zasad lub małe delecje w genie łańcucha ciężkiego miozyny . serca u osób z kardiomiopatią przerostową rodzinną, połączyliśmy technikę nested PCR z testem ochrony przed RNazą. Figura 2A ilustruje tę technikę. Większość mutacji punktowych można wykryć za pomocą testów ochrony RNase A. 30, 36, 37 Niedopasowane pary zasad wykryte przez RNazę są doskonałymi kandydatami do mutacji wywołujących chorobę. Aby ocenić przydatność tej metody do wykrywania nowych mysich mutacji łańcucha ciężkiego miozyny ., wyizolowaliśmy mRNA z linii komórek Epsteina-Barra transformowanych wirusem pochodzących od osób dotkniętych chorobą w różnych, niepowiązanych rodzinach. Próbki RNA wykorzystano jako matrycę w PCR z zagnieżdżonymi starterami (Fig. 1A, A i B, a następnie A i B ), a zamplifikowane nici testowe DNA hybrydyzowano z sondą ciężkiego łańcucha . serca miozyny (Fig. 1A) dla testów ochrony przed RNazą (Fig. 2B). Chociaż to oznaczenie daje złożony wzorzec pasm, nowe fragmenty są łatwo identyfikowane z powodu homogeniczności wzorów w niezwiązanych probandach (Fig. 2B, ścieżki do 3). Unikalny prążek występuje w próbce analizowanej na ścieżce 3 z figury 2B. Aby wykluczyć możliwość pojawienia się tego pasma, ponieważ wprowadzono błędne sekwencje podczas sekwencyjnych PCR, analizowano drugą próbkę RNA od tej osoby. Ta analiza potwierdziła obecność nowego zespołu, sugerując różnicę sekwencji między DNA chorego a DNA od osoby nie dotkniętej chorobą. Ponadto, przeszukaliśmy wszystkie inne regiony kodujące peptyd łańcucha ciężkiego . serca miozyny i nie wykryliśmy żadnych innych nieprawidłowości w tej osobie (dane niepokazane).
Rycina 3. Rycina 3. Rozpoznanie kliniczne i genetyczne kardiomiopatii rodzinnej przerostowej w rodzinie QQ. Rodowód rodowy jest pokazany na panelu A. Męscy członkowie rodziny są oznaczani przez kwadraty, członkowie żeńscy przez kółka, zmarli członkowie przez ukośnik, dotknięci członkowie przez stałe symbole, nietknięci członkowie przez otwarte symbole i członkowie, których status choroby był nieokreślony przez splatane symbole . Stan choroby był oparty na analizie klinicznej. Ponumerowani członkowie rodziny byli dostępni do oceny klinicznej i genetycznej.
Panel B pokazuje wyniki analizy genetycznej pokolenia III. Genomowy DNA ekstrahowano z dwóch niezależnych próbek krwi pobranych od członków rodziny QQ i amplifikowano przez PCR ze starterami B9.1F i B9.1R. Produkty trawiono enzymem restrykcyjnym EcoRI i frakcjonowano zależnie od wielkości na 3% NuSieve i 1% żelu agarozowym zabarwionym bromkiem etydyny. Próbki od osób o normalnej sekwencji zawierały dwa fragmenty składające się z 79 i 45 pz. Próbki od osób z sekwencją zmutowaną zawierały te fragmenty i fragment długości 124 bp, ponieważ mutacja QQ znosi wewnętrzne miejsce EcoRI. Analizę członka rodziny III-14 przeprowadzono niezależnie (dane niepokazane).
Aby ustalić, czy ta różnica w sekwencji jest sprzeczna ze stanem chorobowym, zbadaliśmy rodzinę tej osoby (Family QQ); część rodowodu pokazana jest na rysunku 3A
[przypisy: andrzej wrona twitter, seminogram kraków, olx tomaszów mazowiecki ]