Mutant Neurogenin-3 w Wrodzonej Malabsorptive Diarrhea ad 5

None oznacza komórki, do których NEUROG3 nie został wprowadzony. .-Aktyna służyła jako kontrola wewnętrzna dla równego obciążenia białkiem. Panel C pokazuje wiązanie elementu promotora NeuroD1 do NEUROG3-E47. Test przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej przeprowadzono z użyciem rekombinowanego białka (E47 lub NEUROG3-E47) i znakowanego oligonukleotydu dupleksowego (NeuroD1 E-box 1). Rekombinowany E47 sam (ścieżka 2), NEUROG3 typu dzikiego (ścieżki 3, 4 i 5) lub zmutowany NEUROG3 – R107S (ścieżki 6, 7 i 8) lub R93L (ścieżki 9, 10 i 11) – związany z dupleksami oligonukleotydowymi. Tworzenie kompleksów ze znakowanymi dupleksami oligonukleotydowymi zmniejszało się proporcjonalnie w obecności 10 i 100 razy podstawowej liczby niewyznakowanych dupleksów oligonukleotydowych (wzrastające poziomy wskazane przez rosnące nachylenie czarnych trójkątów). Panel D pokazuje wyniki translacji in vitro E47 i NEUROG3 (formy dzikie i zmutowane) znakowane [35S] metioniną i wizualizowane na 12% żelu akrylamidowym, aby potwierdzić ich względne rozmiary i obfitość. Po związaniu z innym czynnikiem transkrypcyjnym, E47, NEUROG3 aktywuje transkrypcję genu NEUROD1.8 Dokładniej, heterodimer NEUROG3-E47 wiąże dwa dobrze scharakteryzowane elementy DNA E-box (zwane E-box i E-box 3), które leżą w regionie promotora NEUROD1; takie wiązanie ma kluczowe znaczenie dla aktywacji NEUROD1 przez heterodimer.8 Wektor reporterowy złożony z trzech kaset E w regionie promotorowym NEUROD1, a następnie genu lucyferazy został kotransfekowany, wraz z dzikim wektorem ekspresyjnym NEUROG3, do HeLa. komórki. Uzyskana aktywność promotora była pięciokrotnie wyższa niż w przypadku kontroli ujemnej (Figura 3A). Zaobserwowaliśmy jednak niewielką aktywność promotora, gdy zastąpiliśmy dziki wektor ekspresyjny NEUROG3 wektorem kodującym mutant R93L lub R107S NEUROG3. Western blot transfekowanego, znakowanego flagą NEUROG3 ujawnił w przybliżeniu równe ilości postaci dzikiego typu i zmutowanych (Figura 3B). W związku z tym doszliśmy do wniosku, że mutacje powodują, że NEUROG3 nie jest w stanie indukować ekspresji genu NEUROD1 w tym teście przejściowej transfekcji.
Interakcja między NEUROG3 i promotorem NEUROD1
Aby wyjaśnić mechanizm, dzięki któremu mutacje NEUROG3 zapobiegły aktywacji promotora NEUROD1, ocenialiśmy zdolność każdego zmutowanego białka do interakcji in vitro z E-boxem w promotorze NEUROD1. Homodimer E47 wiąże się z elementem DNA E-box w specyficzny sposób (linia 2 na Figurze 3C). Z kolei NEUROG3 typu dzikiego nie wiązał DNA w nieobecności E47 (dane nie pokazane), ale heterodimer NEUROG3-E47 tworzył obfity i specyficzny kompleks, wskazujący na silne wiązanie między heterodimerem a elementem DNA (ścieżki 3, 4 i 5 na Figurze 3C). Przeciwnie, zmutowany NEUROG3 (kodowany przez konstrukty zawierające mutację R93L lub R107S) generował mniej sygnału niż NEUROG3 typu dzikiego, co wskazuje na słabsze wiązanie (ścieżki 6 do 11 na Figurze 3C). W tej analizie użyto w przybliżeniu równe ilości E47 i NEUROG3 (zarówno typu dzikiego, jak i zmutowanych) (Figura 3D). Te dane sugerują, że niepowodzenie zmutowanego NEUROG3 w zwiększaniu aktywności promotora NEUROD1 jest spowodowane, przynajmniej częściowo, jego upośledzoną zdolnością do wiązania promotora NEUROD1.
In Vivo Aktywacja NeuroD1
Rysunek 4
[więcej w: piperine forte gdzie kupić, chirurgia estetyczna kraków, okulista na nfz gdańsk ]
[podobne: seminogram, tokovit, mykofenolan mofetylu ]