Amyloidoza z powodu mutacji genu gelsoliny w amerykańskiej rodzinie z dystrofią rogówki typu II czesc 4

Western Blot białek rogówki z Propositus z dystrofią rogówki kratownicy typu II i od pacjenta z dystrofią rogówki kratownicy typu I. Jako sondę zastosowano anty-FAF w rozcieńczeniu 1: 100; Zastosowano 8 procent żeli siarczanu dodecylu i poliakryloamidu sodu. Ścieżka zawiera radioaktywny marker o masie cząsteczkowej 69; grot wskazuje na górę żelu, gdzie pozostają białka wyłączone z niego. Plamy białek w ścieżkach 2 i 3 wykazały tylko materiał o wysokiej masie cząsteczkowej, który nie dostał się do żelu.
Nierozpuszczalne białko o dużej masie cząsteczkowej, w tym włókienka amyloidu, izolowano z zamrożonej tkanki rogówki z propositus uzyskanego w czasie keratoplastyki. Próbki kontrolne obejmowały materiał uzyskany przy keratoplastyce od dwóch pacjentów z dystrofią krtaniową typu I oraz od dwóch osobników, którzy nie mieli amyloidozy. Tego materiału nie można było solubilizować w buforze do elektroforezy dodecylosiarczanu sodu i poliakryloamidu, zawierającym 0,1 mola ditiotreitolu na litr i wykluczono go z 8% żelu. Jedynie materiał wyizolowany z rogówki propositus zareagował z surowicą anty-FAF na analizę Western blot (ryc. 4). Surowica anty-FAF nie wiązała się z wykluczonym materiałem o dużej masie cząsteczkowej uzyskanym z rogówki pacjentów z dystrofią krtaniową typu I lub od zdrowych osobników, a żadna z tkanek od pacjentów z dystrofią sieciową typu I lub II nie reagowała z mysie przeciwciało monoklonalne skierowane do końca karboksylowego gelsoliny w osoczu (nie pokazano). Przeciwciało monoklonalne tworzyło jednak pojedyncze pasmo (około 90 kD) z surowicą od zdrowego osobnika, odpowiadające cyrkulującej postaci gelsoliny.22
Figura 5. Figura 5. Wyniki amplifikacji fragmentu gelsoliny o długości 115 pz. DNA gelsoliny zamplifikowano za pomocą PCR ze starterami pokazanymi na Figurze 2B i hybrydyzowano w warunkach o wysokiej ostrości z oligonukleotydem specyficznym dla mutacji.24 Ścieżka zawiera DNA amplifikowany z próbki z biopsji doodbytniczej z propositus. Ścieżka 2 zawiera fragment wykazujący substytucję adeniny dla guaniny przez bezpośrednie sekwencjonowanie DNA i ścieżkę 4, produkt PCR otrzymany z próbki krwi obwodowej od córki propositus. Ścieżki 3 i 5 zawierają produkty PCR od dwóch osobników kontrolnych. Wszystkie ścieżki obciążono równymi ilościami DNA, co potwierdzono przez barwienie bromkiem etydyny (dane nie przedstawione). Pas w ścieżce 2 jest ciemniejszy niż pasma w ścieżkach i 4, ponieważ klonowany DNA, w przeciwieństwie do produktu PCR, jest homozygotyczny pod względem mutacji.
Fragment 115 par zasad (bp), który obejmował mutację znalezioną u pacjentów z FAF (ryc. 2), został zamplifikowany przez PCR z genomowego DNA o wysokiej masie cząsteczkowej otrzymanego z leukocytów krwi obwodowej córki propositus, który ma dystrofię sieciową; trzech innych nie dotkniętych chorobą członków rodziny; i niespokrewnione osoby kontrolne. DNA propositus amplifikowano z próbki biopsji odbytnicy uzyskanej w 1982 r .; jednak próbka była ujemna pod względem amyloidu. Te próbki DNA hybrydyzowano z oligonukleotydem specyficznym dla mutacji w opisanych uprzednio warunkach.24 Tylko DNA od propositus i jego córki (Fig.
[przypisy: rurki windi, ectoskin p7, amoksiklav zawiesina ]